宍戸 雅宏

Abstract We screened for bacteria that may facilitate the suppressive effect on Ralstonia pseudosolanacearum at temperatures < 30 °C after anaerobic soil disinfestation (ASD) with 1% v/v ethanol. Among 22 isolates grown anaerobically, we selected three that significantly suppressed R. pseudosolanacearum population after ASD at 25 °C. Based on the 16 S rRNA sequences, two isolates were inferred as Paenibacillus polymyxa and the other as Paenibacillus sp. Using qPCR primers designed for these strains, we found that all strains increased in the soil after ASD at 25 °C. After ASD with 1% v/v ethanol and with or without soil inoculation with these three strains in a concrete frame in the field at mean temperature of 26.3 °C, the R. pseudosolanacearum population was significantly lower in the inoculation treatment at a depth of 10 cm. These results suggest that these Paenibacillus strains have the potential to promote the ASD effect using 1% ethanol at low temperatures.

Bacterial Leaf Blight (BLB) is one of the main diseases in Indonesia that causes a 90% reduction in grain weight. Multispectral imaging may be used as a quick and effective method for damage assessment and is expected to utilize on agricultural insurance in Indonesia. Data were collected at the rainy season and dry season 2018 in Farmers rice field at Bali Province. Vegetation indices (NDVI, GNDVI, and VARI_red-edge) was analyzed using QGIS 2.18 from multispectral images. Some vegetation index shows positive correlation with SPAD and negative correlation with DSI (%). VARI_red-edge has a higher relationship with DSI (R²: 0.8443) than NDVI (R²: 0.8291) and GNDVI (R²: 0.5463) at the average value on each location, but the relation seems to be affected by that relation between SPAD and LAI. Further data and analysis are required.

© 2018 International Society for Horticultural Science. All rights reserved. The effects of the jasmonic acid derivative n-propyl dihydrojasmonate (PDJ) on the volatile emission and on the expression of the aroma-related genes in 'Tsugaru' apples infected by a pathogen (Colletotrichum gloeosporioides) were examined. The fruits were dipped into 0.4 mM PDJ solution before being inoculated with the pathogen and were stored at 25°C for 10 days. The application of PDJ induced ethylene production in the infected fruit. The major volatiles in 'Tsugaru' apples are aldehydes, esters, alcohols and á-farnesene. Esters and α-farnesene were induced by the inoculation, and PDJ application stimulated these emissions. The pathogen inoculation induced the expression of the alcohol acyltransferase gene (MdAAT) and α-farnesene synthase gene (MdAFS) 24 h after inoculation. Apples to which PDJ was applied before pathogen inoculation showed the highest increases in MdAAT and MdAFS expression, followed by apples that received the inoculation only, with the untreated controls showing the lowest expression. These results suggest that PDJ application before pathogen inoculation influenced the aroma volatile emission, which was mediated by ethylene production, and induced greater expression of aroma-related genes compared to pathogen inoculation only in apples.

White root rot of Japanse pear caused by Rosellinia necatrix was investigated in two orchards of the Center forEnvironment, Health and Field Sciences, Chiba University. The bait twig method coupled with PCR primers specificto the fungus indicated at least 28.9% of Japanese pear trees were infected with the pathogen. Because the detectionefficiency of the method is often less than 80 % , the disease was likey more prevalent than the detectedsamples in the orchards. Furthermore, Japanese pear trees that R. necatrix was detected had significantly shorternew shoots than trees that the pathogen was undetected, showing negative impact of the disease infection on thegrowth of host plants. Genetic polymorhisms of R. necatrix isolated from the orchard and other areas of Japan, inaddition to kin speceis: R. aquila and R. compacta, based on six UP-PCR primers exhibited no identical polymorphicpatterns among these Rosellinia isolates. This result suggests that R. necatrix of the orchard is genetically differentfrom isolates living in other areas of Japan.

This review article was originally prepared for use as supplemental reading material of "Special Course forProtected Horticulture I" in the Graduate School of Horticulture, Chiba University. The contents, therefore, aredirected mainly to graduate students majoring in horticulture-related studies. However, professionals in the fi eld ofresearch and implementation of disease management in protected horticulture might well be interested in somesections. First, the article presents discussion of cultural practices for controlling plant diseases that affect vegetableand ornamental crops grown in protected environments such as greenhouses and plastic tunnels. The major diseasesare then described based on pathogen types: fungi, bacteria, and viruses that are common in protected horticulturefacilities in Japan. This section specifi cally examines symptoms of host plants, characteristics of pathogens, andcontrol measures that are currently available to prevent each disease from infection and development. Finally, aprospective assessment will also be presented regarding plant disease management in protected horticulture.

葉に代表される植物体地上部の表面である葉圏には,多種多様な細菌が存在し,植物の健康維持や生態系における物質循環において重要な役割を担っていると考えられる。葉圏細菌に関する研究は,特定の機能を持つ菌を分離・培養し,それらの性質を調べる手法で行われてきた。これまで,細菌群集全体の構造や動態に関する研究は他の環境(根圏や水圏等)と比較すると著しく少なかったが,2001年以降,葉圏においても非培養法による細菌群集全体の構造解析が行われるようになり,知見が蓄積されつつある。本稿では,葉圏細菌群の生存戦略,および注目すべき機能について概説し,さらに,非培養法による細菌群集の解析によって明らかになってきた知見および今後の展望について論考した。

We developed a method for <direct>___- D__-NA i__-solation from p__-hyllosphere microbial communities, designated Direct-DIP. This method comprises DNA extraction from non-shredded leaves with benzyl chloride, and DNA purification by gel filtration. Scanning electron microscopy showed that epiphytic microorganisms were completely removed from the leaf surface after benzyl chloride treatment, while microstructures of the leaf were not damaged. Clear DGGE profiles were obtained regardless of the plant species. Shannon diversity indices of DGGE profiles by Direct-DIP were higher than those by a conventional method. Our findings suggest that Direct-DIP is a rapid, simple, and cost-effective method of extracting DNA from phyllosphere microbial communities.

小麦フスマを用いた還元処理土壌より分離した細菌の中から,単独で処理した場合にもトマト萎凋病菌に対し通常の還元処理と同様の殺菌効果を示す3菌株を選抜した。これらの菌株は単独処理しても還元処理土壌に特有の腐敗臭が発生した。また,この腐敗臭を含む還元処理土壌からの気体には,トマト青枯病菌に対しては殺菌的な,トマト萎凋病菌には静菌的な作用が認められた。PCR-DGGE解析により,還元処理土壌中ではKlebsiella pneumoniaeやEnterobacter sp.のような細菌群が優占化していたが,単独で処理した場合に殺菌効果が得られた3菌株由来のバンドも還元処理土壌のDGGEに認められ,16SrDNA配列からこれらの菌株は全てClostridium sp.であることが示唆された。以上のことから,還元処理土壌中における殺菌機構として,トマト青枯病菌に対しては,土着の嫌気性細菌が産生する揮発性物質や有機酸による直接的な殺菌作用が,これに加えてトマト萎凋病菌の場合には,厚膜胞子の発芽や揮発性物質による静菌作用が効果的に作用していることが考えられた。

小麦フスマを土壌に2t/10aの割合で混和し,潅水・被覆した土壌還元消毒法によって,トマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycopeysici)の分生子および厚膜胞子の生存は有意に抑制されることが示された。このとき,予め土壌を殺菌することで,病原菌に対する生存抑制効果が失われることから,本法による殺菌効果には土壌微生物が関与していることが示唆された。また,酸化還元電位や土壌pHの変化,FDA加水分解による微生物活性および土壌希釈平板法の結果から,土壌還元化によって顕在化してくるのは,通性嫌気性の細菌群であることが考えられた。PCR-DGGEによって土着の細菌群集構造の経時的変化を調査したところ,還元処理による特異的なバンドが数本認められ,土壌還元消毒による殺菌効果には特定の細菌群の台頭が関与していること,また,その細菌群集構造の変化は土壌還元処理後3日目には既に収束していることが示された。

緑肥エンバク野生種の栽培・すき込み後のトマト土壌病害の発生をピシウム苗立枯病, リゾクトニア苗立枯病, 萎凋病, 半身萎凋病および青枯病を対象に調査した結果, 半身養凋病のような進行の遅い土壌病害の発生が抑制され, 特に非殺菌時にその効果が顕著に認められた.その原因として, エンバク野生種栽培・すき込みに伴う土着の土壌微生物相の量的および質的変化による影響が, 希釈平板法, 微生物活性量およびPCR-DGGE法から示唆された.また, エンバク野生種由来の化学物質の抗菌性が関係している可能性も示した.

浄水ケーキを培土に用いた野菜育苗時にPythium aphanidermatumによる苗立枯病に対し,有効な新規バイオコントロールエージェント(BCA)を探索することを目的に,様々な土壌より分離した微生物を供試し,発病抑制能力を評価すると共に,菌を同定し微生物学的特徴を検討した。選抜を検討するためのキュウリ苗を用いた植物アッセイ条件を予め確立し,選抜の最初から用いた。微生物の分離源には環境条件の異なる22地点で採集した根圏または非根圏土壌を用い,細菌224菌株と糸状菌56菌株を希釈平板法によって単分離した。これらの微生物をPaphanidermatum汚染土に接種し,苗立枯病の軽減を指標に3回の植物アッセイを行った結果,細菌4菌株および糸状菌4菌株に有意な発病抑制効果が認められた。細菌はすべてArthrobacter属菌と同定され,糸状菌3菌株はPaecilomyces属菌,Malbranchea属菌, Cunninghamella属菌と同定されたが,糸状菌1菌株は分生子不形成のため同定不可能であった。ピシウム苗立枯病のBCAとして,これらの微生物の報告はデータベースから検出できなかった。このBCA菌株の新規性は,選抜に浄水ケーキを培土とした植物アッセイを用いたことが関係しているかも知れない。また,BCA菌株とP. aphanidermatumを対峙培養したところ,糸状菌の1菌株だけが抗菌性を示した。したがって,選抜された8菌株中7菌株は抗菌性以外の病害抑制機構を持つことが示唆された。

Verticillium dahliae Klebahn is the causal agent of tomato wilt disease. Isolates of V. dahliae can be classified based on pathogenicity to tomato, but the pathotypes are indistinguishable in morphology. We designed PCR primers for specific detection of isolates pathogenic to tomato (tomato pathotype) from the sequences of a pathotype-specific gene, vdtl. With the primer pair Tg5/Tc3, a PCR product (approximately 3.2 kb) specific to tomato pathotype was amplified from the genomic DNA of isolates. Using the primer pair, a tomato pathotype isolate was specifically detected from hypocotyls of inoculated tomato and eggplant. On the other hand, no amplification was observed from non-tomato pathotype isolates of V. dahliae, some other wilt pathogens of tomato and a healthy host plant. Therefore, the primer pair can be useful for pathotype-specific detection of V. dahliae as well as for diagnosis of wilt disease of tomato plant.

Verticillium dahliaeのゲノムDNAからクローニングしたトマト系菌株特異的DNAプローブの一つVDf130の内部には,転写領域が存在することが判明した。これを遺伝子(vdtlと命名)の一部と想定し,転写領域およびその周辺のゲノムDNAとcDNAの塩基配列を決定した。その結果,転写領域には二つのイントロンに分断された137アミノ酸をコードする推定ORFが見出され,また転写領域の上流にはTATA boxやCAAT boxも認められた。しかし,vdtlの塩基配列あるいは推定アミノ酸配列に相同性のある遺伝子やタンパク質は,既存のデータベースからは見出されなかった。一方,サザンおよびノーザン解析により,vdtlは調査したV. dahliae 19菌株のうちトマト系菌株だけに分布し,培養によって得た菌糸や胞子,微小菌核,さらにトマトに感染した状態においても転写されていることがわかった。

制限酵素を介した遺伝子挿入(REMI法)によってトマト萎凋病菌の病原性欠損変異株を作出し,それらの性状解析を行った.ハイグロマイシン耐性を示した82変異株から病原性が明らかに野生株よりも低下しているB02とH15の2変異株が選抜された.これら2菌株は標準的な寒天培地上では正常な生育を示したが,トマト導管内におけるの菌糸の蔓延速度は野生株と比べて著しく遅延していた.この菌糸蔓延の遅延程度はトマト萎凋病の外部・内部病徴の病徴発現と良く相応していたことから,2つの変異株は導管内における菌糸の蔓延が阻害されたために,トマトに対する病原性を低下させたことが示唆された.さらに,これら2菌株は,その培養ろ液のみでも野生株に比べてトマトの萎凋速度を遅延させることから,フザリン酸のような萎凋毒素の生産に関連する遺伝子が破壊されていることも示唆された.また,サザン解析の結果から,これら2変異株でのプラスミドヴュクターの挿入様式は1ないし2コピーの単純な挿入であることが判明した.しかし,これら2変異株は共に毒素生産に関わる病原性を完全には失っていないことから,Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiciによるトマト萎凋病の発現には,本実験で破壊された遺伝子とは別の遺伝子も関与していることが示された.

Veyticillium dahliaeの特定の病原菌群の判別を目的として,V. dahliaeトマト系菌株(TV103)ゲノミックDNAのEcoRI消化断片をプラスミドベクターpUC18に挿入して作成したゲノミックライブラリーから,V. albo-atrumおよびFusarium oxysporumのDNAとは全く反応せずにTV103のDNAに特異的にハイブリダイズするプラスミドクローンを探索した。選抜したDNA断片挿入プラスミドをプローブとして,V. dahliaeの各種分離株およびそれ以外の菌株のDNAに対してドットプロットハイブリダイゼーションを行ったところ,V. dahliaeのすべての菌株に反応したものが2クローン,種内のトマト系菌株に特に強く反応したものが2クローン見いだされた。これらのクローンに挿入されているDNA断片をそれぞれプローブに各種菌株DNAとのサザンハイブリダイゼーションを行った結果,いずれも特異性を示した菌株に対しては共通のバンドパターンを検出した。トマト系菌株に特異性があったDNA断片の一つをさらに細断して解析した結果,トマト系菌株だけにしかハイブリダイズしない,より特異性の高い領域が存在した。したがってこのDNA領域は,V. dahliaeのトマト系菌株の判別に有効なプローブとして利用可能と考えられた。