知花 博治

Because of its high discriminatory potential, fragment analysis of microsatellites has been frequently used for genotyping of Candida albicans at the strain level. In order to evaluate a genotyping system based on the fragment analysis of microsatellites combined with PCRs targeting 25S rDNA and RPS, 456 independent strains of C. albicans were subjected to genotype analysis using 4 microsatellite markers (CDC3, HIS3, CAI and CAIII), followed by 25S rDNA and RPS-based genotyping. The fragment analysis using CAI showed the highest discriminatory potential (DP=0.9782), followed by HIS3 (DP=0.8780). Using combined microsatellite markers, 456 C. albicans strains were divided into 384 genotypes (DP=0.9984). PCRs targeting 25S rDNA and RPS were performed to differentiate the strains that showed identical genotypes in the fragment analysis, resulting in 434 genotypes (DP=0.9996). The combined genotyping system showed high discriminatory power at the strain level and therefore is useful for rapid genotyping in molecular epidemiological studies of candidiasis.

演者等は、カンジダ症の原因菌として最も高頻度に分離されるCandida albicansの感染経路の特定および感染予防を目的とした高精度株レベル識別系の確立を進めてきた。これまでに、C. albicansのRPS/ALT領域の構造の多様性が、本菌種の特異的同定とタイピングに有効であること。さらに、RPS/ALT解析にマイクロサテライトのフラグメント解析を加えることにより、C. albicansを株レベルで識別する能力が高まることを報告してきた。本総会では、RPS/microsatellite解析によるC. albicansの株レベル識別能の評価と、genotype variationにつて報告する。日本、ブラジルおよびタイで分離された合計117株のC. albicansは、4種類のmicrosatellite markerにより104種類のgenotypeに区別され、さらにRPS/ALTタイプの解析を加えると112種類のgenotypeに区別（DP=0.999）された。これに対し、同一患者に由来するC. albicansでは、分離部位（常在部位と感染部位）に関係なく、同じgenotypeを示した。現在、C. albicansのgenotypeのvariationと安定性を調べるために、解析株の数を増やすと共に、同一患者から複数回分離したC. albicansのgenotype解析を進めており、これらの結果も合わせて報告したい。 （会員外共同研究者：足立秀禎、清水和栄）

【目的】病原真菌Candida glabrataは、出芽酵母とは異なり好気条件でも血清や胆汁からコレステロールを取り込んで、アゾール剤によるエルゴステロール合成阻害を回避する。本研究では、ステロールトランスポーターCgAus1pによるステロール取り込みの分子機構と生理的役割を明らかにすることを目的とした。【結果と考察】CgAUS1および出芽酵母のortholog遺伝子ScAUS1、ScPDR11をそれぞれ恒常的に発現させた出芽酵母株を作製し、フルコナゾールによるエルゴステロール合成阻害が血清の添加によって回避されるかどうかを検討した。好気および嫌気培養条件におけるフルコナゾール感受性を比較した結果、CgAUS1発現株はScAUS1およびScPDR11発現株と同様に嫌気条件下でのみ、血清添加によって耐性化した。また、出芽酵母の細胞壁マンノプロテインをコードするDAN1遺伝子はステロールの取り込みに必要であると考えられている。DAN1を破壊すると、CgAUS1発現株も血清によるフルコナゾール耐性化は著しく損なわれた。本研究により、出芽酵母とC. glabrataには共通のステロール輸送機構が存在すること、またステロール取り込みに関わる因子が出芽酵母では嫌気条件でしか発現しないのに対して、C. glabrataでは好気条件においても発現することが示唆された。

During the last two decades, numerous scientists have focused on molecular studies of fungal pathogenesis and development of antifungal drugs, yet many problems haven't been resolved due to technical difficulties in studying specific fungi. With the completion of genome sequences of the major fungal pathogens, knowledge gained from study of a specific fungus can immediately be applied to other fungi, using genomics as a platform. Of several dozen fungal species causing disease in humans, Candida glabrata is the most amenable species for molecular biology. For this reason, C. glabrata is a good resource for basic studies that may be applicable to many pathogenic fungi. The C. glabrata phenome project consists of an effort to construct a library of strains bearing mutations in single genes. Essential genes will have a regulatable promoter inserted at the 5' position, whereas all dispensable genes will be knocked out. <BR>The first aim of this project is prioritization of drug targets amongst the 5,300 C. glabrata genes. Genes representing potential new antifungal drug targets must be essential for growth, and highly conserved in other pathogenic fungi to ensure drugs will have a broad spectrum, but should not be conserved in the human genome. Consequently, a few dozen genes have been identified as the high priority candidates. In this talk we present the strategy of the prioritization and challenge of the fusion study of in silico and experimental research to develop new anti fungal drugs.

カンジダ症の主要な原因菌であるCandida albicansおよび一倍体ゲノムで遺伝子解析の比較的容易とされるC. glabrataにおいては、必須遺伝子の解析にとくに有用なTETシステムが中山ら (Microbiol., 1998, Infect. Immun., 2000) によってすでに確立されている。また、これら２菌種においては、ゲノムの全塩基配列が相次いで決定されている。こうした事実を背景に、われわれはカンジダ症対策の一環として、C. albicansおよびC. glabrataをおもな材料に用い、これらに対する抗真菌剤の標的候補としての必須遺伝子に着目した。両菌種のリン酸代謝制御系における負の制御因子PHO85につき、TETシステムによる解析を行なったところ、in vitro必須性が立証され、C. albicansの病原性発現においてもその役割の重要性が示唆された。また、ゲノム内の膨大な遺伝子の中から必須遺伝子を効率よく分離・同定する手段として、C. glabrata温度感受性変異株（以下、TS変異株）を宿主に、C. glabrata Genomic DNA Libraryよる形質転換を行ない、各TS変異に対する相補性DNA断片をスクリーニングし、細胞壁合成、形態形成、細胞周期制御、タンパク合成、RNAスプライシング等々の、細胞内事象に必須の遺伝子群が多数分離・同定され、１つの点突然変異によりTS変異が生じていることも明らかになった。以上のような必須遺伝子群は今後、抗真菌剤開発において、その標的候補として重要な意義をもつものと考える。

C. albicansの反復配列であるRPSは内部反復配列ALT（172bp）により構成される。この領域内のALTユニット反復回数は各RPSで異なり、さらにユニットの配列にも違いがみられる。今回、RPS領域のALTユニットの特徴を利用したC. albicansのgenotypingについて検討した。感染者の感染部位と非感染部位、および非感染者の口腔より分離したC. albicansを今回の解析に用いた。精製したDNAはP-II（ALT反復回数）とAS-I（ALT配列順所）で増幅し、パターンを比較した。さらに、P-IIとAS-IによるPCRの結果をmicrosatellite genotying（CDC3, HIS3, CAI, CAIII）の結果と比較した。P-IIで同一の増幅パターンを示す株のいくつかはAS-Iで異なるパターンを示すことから、両プライマーを組み合わせることにより詳細なgenotypingが可能となった。感染部位より分離した複数のC. albicans株についてRPS/genotypingを行った結果、患者の間では異なる増幅パターンを示すが、 同一患者に由来するC. albicansの増幅パターンは同じ（約70%）であった。使用した株のmicrosatellite分析の結果は、RPS/genotypingとほぼ同じであった。（会員外共同研究者：清水和栄, 足立秀禎）

Candida glabrataやAspergillus fumigatusはステロール合成が阻害されると、細胞外から代替ステロールを補充し阻害を相補することが知られている。この機構はアゾール剤耐性とも関連するため、臨床的にもきわめて興味深い。C. glabrataのアゾール剤に対する耐性化にこの機構が関わっていることが十分に考えられ、ステロール合成阻害剤に対する真菌の新しい耐性機構を示唆している。細胞外からのステロールの取り込みは、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeでは主に嫌気条件下で行われ、C. glabrataでは好気条件下でも起こるという相違がある。培地に血清を添加するとステロール成分は菌体内に容易に取り込まれるが、フリーのステロールは適切な溶媒に懸だくしないかぎり取り込まれず、ステロールの取り込みに応じて細胞膜ステロール成分は変化する。我々はステロールの取り込みを担うC. glabrataのトランスポータ遺伝子AUS1を同定し、遺伝子発現の制御と血清中のステロールの取り込みおよびアゾール耐性との関連を報告した。今回は、aus1株のアゾール感受性化を指標に，各種培養条件の下でAUS1発現とこの輸送タンパク質の基質特異性について検討し、ステロール取り込みの意義を考察する。会員外共同研究者 竹森大樹，岡野誠，中西拓也（鈴鹿高専）、高野幸枝（感染研）

【目的】近年、カンジダ症において増加傾向を示すCandida glabrataは既存の抗真菌剤に耐性を示すなど、その生態において不明な点が多い。今回、我々は、呼吸メカニズムの解明を目的として実験を行ったところ、亜硫酸ナトリウムがC. glabrata細胞を肥大させることを見出し、このメカニズム解析を行った。【方法】使用菌株：C. glabrata ATCC2001株をサブロー培地で24時間前培養したものを実験に使用した。細胞肥大の確認：亜硫酸ナトリウム処理したC. glabrataを培養し、形態を確認した。増殖速度の測定：C. glabrataに亜硫酸ナトリウムを添加し菌数を吸光度620nmで測定した。嫌気条件下での細胞肥大の確認：C. glabrataをアネロパック（三菱ガス化学株式会社）を用いて培養し形態を確認した。細胞肥大と硫酸イオンの関係性：硫酸ナトリウム処理したC. glabrataを培養し形態を確認した。【結果・考察】C. glabrataに亜硫酸ナトリウムを添加し培養することで、細胞の肥大化が確認された。さらに、増殖速度を測定したところ亜硫酸ナトリウム添加群の増殖速度は減少していた。他の嫌気条件での細胞肥大を観察する目的でアネロパックを用いて培養し観察行ったところ細胞の肥大は認められず、また硫酸ナトリウムによる細胞の肥大も確認されなかった。これらのことから亜硫酸ナトリウムはC. glabrataの増殖や形態変化に関わるシグナルに影響することが明らかになった。

近年の分子生物学的解析の進歩は生物種の系統分類体系を大きく変貌させてきた．古典的な分類・同定は，形態学的あるいは生理学的な手法により行われてきたが，分子生物学的手法を用いることで DNA の塩基配列の相違などから，形態学的，生理学的にはほとんど同一にみえる生物種であってもさらにサブグループに分類することが可能となった．臨床の場面においては感染症の原因菌について，同定はもちろん感染経路などを探索する場合に，このサブグループの情報が非常に有効であることが知られている．本研究では，病原性酵母 Candida albicans について 2 種類の指標（25S genotype と ALTS）を用いて検討した．<BR>方法：千葉大学真菌医学研究センター保存の C. albicans 1110 株について McCullough 等¹⁾ の方法（25S genotype）による A，B，C のタイプ分けと Chibana 等²⁾ の方法を一部改良した ALTS によるタイプ分けの後，分離源情報とを合わせ検討した．<BR>結果：分離源情報の内，分離国と分離源が明確な株についての比較により以下の点が明らかになった．日本，ブラジル，タイの 3 カ国の比較ではタイにおいて特徴的なタイプの分布割合を示した．分離源においては，AIDS 患者の血液等の内臓由来の菌株で genotype B が高くなっていることが判明した．<BR>1)：McCullough MJ et al.: J Clin Microbiol 37: 417-421, 1999.<BR>2)：Chibana H et al.: J Bacteriol 176: 3851-3858, 1994.

ファルネゾールはC. albicansの菌数認知伝達機構（クオラムセンシング）の伝達分子の一つであるが、果実・野菜などに含まれる精油の成分でもある。<BR>C. albicansにおけるファルネゾールの情報伝達機構については、現在のところ細胞内二成分制御系のCHK1遺伝子の関与(Kruppa M, et al. 2004 Eukaryot Cell)のみ報告されている。またファルネゾールは脂溶性を示し細菌の細胞膜では蓄積されることから、C. albicansでは細胞表層にファルネゾールの受容体が存在するのではないかという作業仮説を立てた。そこでC. albicans のゲノムDNAマイクロアレイの手法を用いた網羅的遺伝子解析を行い、ファルネゾールで発現誘導される膜たん白が想定される遺伝子を２つ選抜した（第49回本大会総会）。動物細胞をファルネゾールで処理すると核内レセプターFXRを発現することから、動物細胞と同様なシグナル伝達が存在するかどうかについてin silico analysisを行ったところ、その配列と選抜した２遺伝子とは相同性を示さなかった。またFXRのオーソログもC. albicansのゲノム配列からは検索されなかった。これら遺伝子の組換え体構築やCHK1との関係などについて報告する。（会員外共同研究者：青山俊弘、鈴鹿高専・電子情報工学、R.Calderone、Gaorgetown Univ.）

Candida albicans, C. glabrata, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus の全ゲノムシークエンスが2004年から相次いで報告されたことから、これらのゲノム情報をプラットフォームとして、遺伝子型解析、マイクロアレイ解析による病原因子の探索、抗真菌薬の標的の探索など様々な分野に応用されている。しかし、各遺伝子の機能についてはSaccharomyces cerevisiaeとの比較解析への依存が高く、特にin vivoでの遺伝子機能については推測の域に留まることが多い。そこで、我々はin vivoを含む網羅的な遺伝子機能情報が、病原真菌研究の第２プラットフォームであると考え、まず4菌種の中で最も遺伝子操作が簡便なC. glabrataを用いて、網羅的な遺伝子の機能解析を進めている。機能解析の過程において、抗真菌薬の開発は最優先課題と考えており、これら４菌種のゲノム情報を元に抗真菌薬の標的候補を約200遺伝子抽出し、各遺伝子のプロモーター領域にテトラサイクリン応答型プロモーターを挿入した株を構築した。今回、それら遺伝子機能解析の進捗状況等を報告する。会員外共同研究者： 笹本 要、住江祐介、木下妻智子(千葉大)、青山俊弘 (鈴鹿高専)、釣谷克樹、中井謙太（東大）

抗真菌薬の多くが，アゾールに代表されるステロール合成阻害剤であるにも関わらず，ステロール取り込みと薬剤耐性機構との関連について取り上げられていなかった。しかしながら，我々の研究等からCandida glabrataやAspergillus fumigatusで，嫌気条件下でしか起こらないとされていたステロールの取り込みが，宿主体内や好気条件下でも起こることが明らかとなった。これは臨床上，アゾールがC. glabrataに効きにくいことと合致し，真菌のステロール合成阻害剤に対する新しい薬剤耐性機構の存在を示唆する。実際，この機構をもつ耐性菌が，従来の培地にステロールを加えることで臨床検体より初めて単離された。ステロールが取り込まれても，エルゴステロールの合成は引き続き起こることから，アゾールの耐性機構の解明およびステロール合成系における新たな分子標的の検索において，ステロールの取り込みと合成の両面からステロールの恒常性維持機構の解明が必要と考え，ステロールトランスポーターの同定と機能解析およびステロール合成に関わる酵素群の機能解析を行っている。本発表では，同定したステロールトランスポーターの条件変異株についての表現型解析について結果を報告し，アゾール耐性との関連を考察する。（会員外共同研究者 鈴鹿高専 青山俊弘，竹森大樹）

現在、わが国は高齢化社会を迎え易感染性宿主における日和見感染症が医療現場の重要な問題になりつつあり、なかでもヒト常在菌である病原性酵母によるカンジダ症はその主要な部分を占めている。Candida属酵母においては一昨年、C. albicansおよびC. glabrataの両者で相次いで全ゲノムシークエンスが公開され、これらの菌種に関する研究も新たな時代を迎えた。これらの菌種においては、Tetracycline (Tet) による応答性遺伝子発現制御系 (TETシステム) が中山ら (Microbiol., 1998, Infect. Immun., 2000) によってすでに確立され、必須遺伝子を解析する上でとくに有利であることが立証されている。こうした背景から、われわれはカンジダ症対策の一環として、カンジダ症の主要な原因菌とされるC. albicansおよび通常一倍体として増殖するために遺伝解析が容易とされるC. glabrataをおもな材料として、新たな抗真菌剤の標的となり得る必須遺伝子群の探索を試みている。 われわれは必須遺伝子を効率よく分離・同定する一つの手段として、一倍体ゲノムをもつC. glabrataの温度感受性変異（以下、ＴＳ変異）株を用いる方法を考案した。ＴＳ変異体は、低温では正常に増殖できるが、特定の遺伝子の変異により高温（発育制限温度）においてその遺伝子産物（タンパク）の高次構造が変化したことにより不活性化し、その結果、高温でのコロニー形成能を欠損したいわゆる条件致死変異体の一種である。これまでに当研究室において得られた多数のＴＳ変異株について性状解析を行った結果、その多くは安定性が高く、Reversion頻度が低いこと等から、これらの変異株を宿主としてC. glabrata Genomic DNA Library より各変異に対する相補性遺伝子のスクリーニングを行った。これまでに様々なＴＳ変異に対する相補性遺伝子の解析から、細胞周期制御、形態形成、細胞壁合成系、タンパク合成系等、種々の重要な細胞内事象に必須のタンパクがＴＳ変異により異常を呈していることが示された。また、これらとは別に、TETシステムを用いることにより、C. albicansのリン酸代謝制御系における負の制御因子PHO85がin vitro, in vivo の両面において重要な役割を果たしていることも示された。以上の結果より、これらの遺伝子群は、将来、抗真菌剤開発に際しての有力な標的候補になる可能性が示唆された。

菌数依存的に生物活性を制御するシステムをクオラムセンシング (quorum-sensing) という. このシステムはautoinducerを介して起こり, その種類は多い. この物質を介したクオラムセンシングのシグナルは, 外毒素, プロテアーゼ, 色素産生など病原因子の制御に関わる. 即ち病原細菌のクオラムセンシング機構は病原性発現における重要な役割として注目されている.<br>病原性真菌Candida albicans では最近菌糸形成能の制御に関わるクオラムセンシング分子 (quorum-sensing molecule) の単離に成功した. Candida albicans は医療機器にバイオフィルムを形成することから, 菌糸形成を制御するクオラムセンシング機構はバイオフィルム形成との関係で特に注目されている.

一般に感染症対策として特定の病原微生物に対して抗菌性をもつ薬剤を開発する際には, その標的となる分子が菌の増殖にとって必須であるか否かが一つの重要な点となる. われわれはこの観点から, 抗真菌剤の標的候補としての必須遺伝子に着目している. ここでは, 通常一倍体として増殖するCandida glabrata の温度感受性変異株を用いた必須遺伝子群の探索に関する研究の一端を紹介するとともに, カンジダ属酵母のなかで最も病原性が強いとされるC. albicans より分離したリン酸代謝制御系 (PHOシステム) における負の制御因子として知られるPHO85 の必須性に関する研究についても言及する.

Candida albicans のゲノムにはMRS (major repeated sequence) を中心とする数種類の反復配列が含まれている. 2004年にC. albicans の全ゲノム配列が発表されたが, MRSが主な原因となりassembleとfinishingを困難にし, 現在でも染色体ごとに1本に編集されたゲノム配列の報告には至っていない. しかし, 一方でMRS (Ca3, 27A, RPSが含まれる.) は, 菌株ごとにシークエンスやサブリピート構造に多型性を現すため, 種の簡易同定や菌株の分類同定などに用いられ, C. albicans の疫学調査に役立てられて来た. ここでは, MRSの構造解析から全ゲノム構造解析に至るまでの過程とMRSの菌株分類への応用や, さらに最近の知見からMRSが, C. albicans の交配型や薬剤感受性, 糖の資化性など様々な形質に関与することが分かって来たことを紹介する.

Background: Candida albicans is one of the most important etiologic agents causing superficial and deep fungal infections. For prevention of candidiasis, it is important to develop a rapid system that discriminates C. albicans at the strain level. Objective: To develop a system that can identify C. albicans at the strain level. Methods: Genomic DNAs were purified from 179 clinical isolates of C. albicans, and were used as templates for PCR amplification of 25S rDNA and ALT repeats in repetitive sequences (RPSs). PCR products generated from ALT repeats were digested with EcoRI and/or ClaI in order to study the relationships between restriction profiles and amplification profiles. Results: One hundred and seventy nine clinical isolates were grouped into genotypes A (92 isolates), B (38 isolates) and C (49 isolates) on the basis of their 25S rDNA, and each was further classified into five types (types 3, 4, 3/4, 2/3/4 and 3/4/5) by PCR amplification targeting ALT repeats. Type 3 C. albicans constituted the majority of isolates in any genotypes (66.3% for genotype A, 76.3% for genotype B and 73.4% for genotype C). Each C. albicans type showed several amplification patterns, indicating the existence of subtypes. RFLP analysis revealed that restriction profiles of PCR products corresponded to amplification patterns from PCR. Conclusion: The present results indicate that PCR amplifications targeting 25S rDNA and ALT repeats are useful for rapid genotyping and distinction of C. albicans involved in superficial candidiasis. © 2005 Japanese Society for Investigative Dermatology. Published by Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

The taxonomic positions of two clinically isolated actinomycetes were established using a polyphasic approach. The two strains, IFM 10032T, isolated from ear discharge of a 28-year-old Japanese female patient with external otitis, and IFM 10148, isolated from pleural fluid of a 60-year-old Japanese male patient with bronchitis, possessed meso-diaminopimelic acid as the diagnostic amino acid, MK-9(H2) as the predominant menaquinone and mycolic acids ranging from 58 to 64 carbons. The 16S rRNA gene sequences of the two strains were most closely related to those of Gordonia aichiensis, Gordonia sputi and 'Gordonia jacobaea'. Differences in several phenotypic characteristics together with genotypic distinctiveness distinguish strains IFM 10032T and IFM 10148 from these three species. DNA-DNA hybridization results and the combination of genotypic and phenotypic data showed that the two strains belong to a single species, and merit recognition of a novel species within the genus Gordonia. The name proposed for this taxon is Gordonia otitidis sp. nov.; the type strain is IFM 10032T (=DSM 44809T =JCM 12355T =NBRC 100426T). © 2005 IUMS.

Two actinomycete strains, IFM 0354T and IFM 0576, isolated from Japanese patients, were found to have morphological, biochemical and chemotaxonomic properties consistent with their classification in the genus Nocardia. The strains resembled Nocardia otitidiscaviarum and Nocardia uniformis in their phenotypic properties. Comparative 16S rRNA gene sequence analysis showed that the strains are closely related to Nocardia seriolae. DNA-DNA relatedness values and phenotypic differences from N. seriolae indicated that the strains belong to a novel species of Nocardia, for which the name Nocardia concava sp. nov. is proposed. The type strain is IFM 0354T (=NBRC 100430T=JCM 12351T=DSM 44804T). © 2005 IUMS.

The size of the genome in the opportunistic fungus Candida albicans is 15.6 Mb. Whole-genome shotgun sequencing was carried out at Stanford University where the sequences were assembled into 412 contigs. C. albicans is a diploid basically, and analysis of the sequence is complicated due to repeated sequences and to sequence polymorphism between homologous chromosomes. Chromosome 7 is 1 Mb in size and the best characterized of the 8 chromosomes in C. albicans. We assigned 16 of the contigs, ranging in length from 7309 to 267,590 bp, to chromosome 7 and determined sequences of 16 regions. These regions included four gaps, a misassembled sequence, and two major repeat sequences (MRS) of >16 kb. The length of the continuous sequence attained was 949,626 bp and provided complete coverage of chromosome 7 except for telomeric regions. Sequence analysis was carried out and predicted 404 genes, 11 of which included at least one intron. A 7-kb indel, which might be caused by a retrotransposon, was identified as the largest difference between the homologous chromosomes. Synteny analysis revealed that the degree of synteny between C. albicans and Saccharomyces cerevisiae is too weak to use for completion of the genomic sequence in C. albicans.