矢口 貴志

症例1:77歳,男性.左前額部の外傷後,同部位に紅色結節と左下顎リンパ節膿瘍が出現した.膿汁からNocardiaが培養され,切開排膿と塩酸ミノサイクリンの内服により治癒した.症例2:79歳,男性.右前腕の外傷後に紅色結節が出現し,生検組織からNocardiaが培養され,ST合剤の内服により治癒した.症例3:85歳,男性.外傷の既往なく左手関節伸側に紅色結節が出現した.生検組織からNocardiaが培養され,外科的切除とST合剤の内服により治癒した.自験例は3例ともに免疫低下を示唆する既往歴のない75歳以上の高齢者であり,分離菌株は生化学的性状と16S rRNA遺伝子の塩基配列からNocardia brasiliensisと同定された.本邦の皮膚ノカルジア症の報告は1995〜2011年に自験例を含め197例あり,原因菌種はN.brasiliensisが最も多く約半数を占め,65歳以上の高齢者に多かった.(著者抄録)

クロモブラストミコーシス（CBM）の主要な原因菌種<i>Fonsecaea</i>属は，近年分子系統解析により再検討され，<i>F. pedorosoi</i>, <i>F. monophora</i>, <i>F. nubica</i>の３菌種が提唱されている．今回，その原因菌の形態学的同定が困難であったが，系統解析により<i>F. monophora</i>と同定することができた慢性重症型CBMの症例を報告する．患者は55歳のフィリピン出身の男性．ココナッツ農園で働いていた1973年ごろ，左下腿に小紅斑が出現．1999年に下腿部から大腿部にかけて皮疹が多発し，同年から2005年まで母国で治療し略治．2005年来日後，下腿の皮疹が再燃し，イトラコナゾールの内服を再開したが悪化してきたため当科を受診．2008年10月初診時，左下腿部に瘢痕型病変と周囲に腫瘤型病変を伴っていた．その病変の上部から大腿にかけて，多数の斑状瘢痕を認めた．腫瘤性病変からmuriform cellを確認，黒色真菌を分離した．集落は，はじめ炭粉状，後に短絨毛様となった．本分離株は顕微鏡所見による菌種同定が困難なため，リボソームRNA遺伝子internal transcribed spacer領域の塩基配列を解析し，<i>F. monophora</i>（DDBJ accession number AB566420）と同定した．治療はボリコナゾール内服とカイロによる温熱療法を併用し，６ヶ月後には腫瘤性病変は消退し，１年６ヶ月で瘢痕様紅斑を残し内服治療を終了した．瘢痕型は薬剤の到達が難しいため再発しやすく，治癒判定も難しいため，今後も経過観察が必要である．

ブラジル土壌から分離した <I>Aspergillus fumisynnematus</I> とアメリカのガン患者から分離された <I>Aspergillus luntulus</I> のタイプ株を MA, PDA 平板を用いて対峙培養をしたところ，接種約3ヶ月後に対峙面に白色の子のう果を形成し，子のう胞子も成熟した．子のう胞子の形態は既知のヘテロタリック <I>Neosartorya</I> の子のう胞子とは異なり新種である事を認めた．子のう胞子を 70℃，30 分の加熱処理をおこない発芽を確認し，両種は同一種であることが示唆された．形成されたテレオモルフは新種<I>Neosartorya fumisynnemata</I> とし，アナモルフは <I>A. fumisynnematus</I> で，<I>A. luntulus</I> はそのシノニムとした．<I>A. fumisynnematus</I> は分生子束を形成する事を特徴として創設された種であるが，今回対峙培養をおこなった株の集落は綿毛状で，分生子束は形成しなかった．しかし，子のう胞子から発芽し生育した集落はビロード状，綿毛状，縄状，分生子束状の多様性を示した．これらの菌の MAT 遺伝型はブラジル産の <I>A. fumisynnematus</I> が MAT-1-1，<I>A. lentulus</I> が MAT-1-2 を示した．子のう胞子から発芽形成された株は MAT1-1 と MAT1-2 が認められた．親株及び F-1 株についてβ-tubulin, calmodulin, actin 遺伝子を用いて系統関係を分析した結果，子のう胞子形成時に染色体の組換えが起こっている事が認められた．

<i>Asperillus novofumigatus</i> IFM 55215 株のメタノールエキスから血小板凝集阻害物質としてジヒドロテレイン（<b>1</b>）およびテレイン（<b>2</b>）を分離・同定した．化合物<b>1</b> および<b>2</b> は濃度5.0 × 10<sup>2</sup> μmol/L の時，レーザー散乱法血小板凝集装置を用いたin vitro 試験の結果，コラーゲンで惹起したヒト血小板凝集を抑制した．化合物<b>1</b> および<b>2</b> のジアセチル化体<b>3</b> および<b>4</b> は，コラーゲンで惹起したヒト血小板凝集をそれぞれ濃度5.0 × 10<sup>3</sup> および5.0 × 10<sup>2</sup> μmol/L で抑制した．また，化合物<b>1</b>-<b>4</b> の中で，コラーゲンおよびadenosine diphosphate （ADP）で惹起したヒト血小板凝集に対して，<b>4</b> が最も強い抑制作用を示した．今回の実験結果で，<b>2</b> はアセチル化により抑制作用が増強することが認められた．

<I>Talaromyces</I> 属およびその関連菌である <I>Hamigera</I> 属，<I>Byssochlamys</I> 属は，子のう胞子が耐熱性を示すことから食品，飲料などの製造過程における事故原因菌として重要である．<I>Talaromyces</I> 属は， <I>Penicillium</I> 以外にも <I>Geosmithia</I>，<I>Paecilomyces</I> をアナモルフにとする種があり，分子系統的にも多系統と指摘され，分類学的に混乱している．今回， 本属および関連菌種の 28S rDNA D1/D2 領域，β-チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し，NJ 法により系統解析を実施した．その結果，2 遺伝子の解析からえられた系統樹はほぼ一致し，<I>Talaromyces</I> 属は 5 群に再分類され，<I>Byssochlamys</I> 属，<I>Hamigera</I> 属とは系統的に明確に区別された． この解析結果を用いて，飲料などの製造工程で問題となる耐熱性カビの検出方法の検討を行った．菌が検出された場合の識別・同定法については，DNA の抽出，増幅条件等の最適化により，新たに開発した耐熱性カビの識別用プライマーを用いて酵母や一般のカビと問題となる耐熱性カビの識別ができ，<I>Talaromyces</I> 属、<I>Byssochlamys</I> 属、<I>Hamigera</I> 属および <I>Neosartorya</I> 属の 4 属を属レベルでの同定が 8 時間以内で可能となった．

<I>Aspergillus</I> section <I>Fumigati</I> に属する菌種において、複数の遺伝子の塩基配列を決定し、関連菌と合わせて系統解析を実施した。その結果、どの遺伝子ともほぼ同様の系統樹を示し、Section <I>Fumigati</I> に属する菌種は I．<I>A. fumigatus</I>、II． <I>A. lentulus</I>、<I>A. fumisynnematus</I>、III．<I>A. fumigatiaffinis</I>、<I>A. novofumigatus</I>、IV．<I>A. udagawae</I>、<I>A. viridinutans</I>、V．他の菌種がそれぞれ属する 5 つのクラスターに分かれた。臨床分離株の多くは I に含まれたが、中には、II、IV に属する菌株があった。各分生子の表面微細構造は、I、V は刺状突起、II、III、<I>A. udagawae</I> は小コブ状の隆起、<I>A. viridinutans</I> は中間的な形状を示した。生育温度は、I が 50℃ でも生育するのに対して、II、III は 45℃ まで、IV、V は 42℃ まで生育し、これは簡便な分類に利用できる。各種抗真菌薬に対する感受性は、<I>A. lentulus</I> をはじめ非典型的な <I>A. fumigatus</I> は amphotericin B に対して、MIC が 1-2 μg/ml となり、高めの値を示した。この解析結果を用いて、臨床上問題となる薬剤感受性の低い菌種検出方法の検討を行った。菌が検出された場合の識別・同定法については、DNA の抽出、増幅条件等の最適化により、新たに開発したプライマーを用いて I、II、IV に属する菌種の識別が 8 時間以内で可能となった。

<I>Aspergillus</I> section <I>fumigati</I> に属する菌種のうち、<I>A. fumigatus</I> はアスペルギルス症原因菌として最も重要な菌であるが、これまで臨床からの分離株には典型的な <I>A. fumigatus</I> 以外の株も混在していた。近年、分子系統解析によって非典型的な株の多くは <I>A. fumigatus</I> とは別種とされている。現在、非 <I>A. fumigatus</I> およびアナモルフのみを形成するヘテロタリックな <I>Neosartorya</I> は 16 種報告されており、このうち <I>A. arvii</I>、<I>A. fumigatiaffinis</I>、<I>A. fumisynnematus</I>、<I>A. lentulus</I>、<I>A. neoellipticus</I>、<I>A. viridinutans</I>、<I>N. fenneliae</I>、<I>N. udagawae</I> がヒトや動物に対しての病原性を示している。今回は日本、中国、ブラジルなどの土壌から非 <I>A. fumigatus</I> を分離し、系統解析の結果と形態学的知見とを比較研究した。その過程で未報告種を認めたので併せて報告する。方法：土壌および臨床分離株と既知種をβ-チュブリン、ハイドロフォビン、カルモジュリン遺伝子などを用いて系統解析を行い、形態学的知見と比較検討した。結果：系統解析の結果、7 クラスターに分類された。概ね系統解析と形態学的知見は一致したが、系統は一致するが形態が異なる例や系統は異なるが形態が一致する例も認めた。これまで <I>A. fumigatus</I> とされていた臨床株の分類的位置を明らかにした。

高度医療の進展に伴い真菌症は増加傾向にあり，その中でも特にアスペルギルス症は重要である．アスペルギルス症は <I>A. fumigatus</I> もしくは <I>Aspergillus</I> section <I>Fumigati</I> に属する菌がその原因の大半を占める．Section <I>Fumigati</I> に属する菌の系統分類と生理学的性状の相関に関する報告は既になされており（Yaguchi et al, 2007），最高生育温度による典型的な <I>A. fumigatus</I> と非典型的な <I>A. fumigatus</I> の区別が可能であることが示唆された．しかし，<I>A. fumigatus</I> 関連菌以外の病原性 <I>Aspergillus</I> 属菌の中には，分類に基づいた性状の把握が十分になされていない菌が存在する．<Br> <I>Emericella</I> 属は <I>Aspergillus</I> のテレオモルフの一つであり，アナモルフは <I>Aspergillus</I> section <I>Nidulantes</I> に分類され，36 種 2 変種のうち 5 種で病原性が報告されている．Verweij ら（2008）は臨床分離株の <I>E. nidulans</I> と <I>E. quadrilineata</I> の MIC を比較し，2 菌種間で複数の抗真菌薬に対する感受性に差があることを報告し，同時に遺伝子配列を用いた正確な種同定の重要性を指摘した（2008）．<Br> 今回，我々は病原性 Emericella 属菌 5 種の MIC を測定し，菌種間による薬剤感受性の差異を明らかにすると共に，種特異的かつ迅速な同定が必要なことから，PCR などを用いた識別法の開発を試みた．

<I>Emericella</I> 属は <I>Aspergillus</I> のテレオモルフの１つであり、アナモルフは <I>Aspergillus</I> section <I>Nidulantes</I> に分類されている。レンズ形、赤紫～青色で赤道面に帯状隆起を持つ子のう胞子を形成し、この子のう胞子の形態が本属の種識別の指標となっている。これまでの研究で我々は <I>Emericella</I> 属の属全体の系統関係を明らかにしてきた。更に分子系統と子のう胞子の形態および最高生育温度やマイコトキシンの生産性など生理・生化学的性状との相関を検討し、多相的な分類を試みた。その結果これら 3 者の間には相関性があることが認められた。<BR> 今回、新たに分離された複数の菌株が、系統的に単一で既存の種と異なるグループを形成した。そこで、SEMによる子のう胞子の形態の観察および最高生育温度を検討し、さらに分子系統的に近縁である種と各種培地上におけるコロニーの大きさを比較した。また、子のう胞子の形態が類似している種との性状の比較およびマイコトキシンの生産性も検討した。その結果、様々な分類指標が既存種と異なる結果を示したため、新種として報告する。<BR> <I>Emericella</I> sp. IFM 55259 - 55265 の子のう胞子の形態学的特徴は、レンズ面が滑面であり <I>E. nidulans</I> に類似しているが、子のう胞子の形は <I>E. nidulans</I> より厚く丸みを帯びた形をしている。また、赤道面帯状隆起の帯の厚みが既存のどの種よりも厚いのが本種の特徴である。系統的には レンズ面に特徴的な隆起を持つ <I>E. rugulosa</I> に最も近いが、子のう胞子の形態は大きく異なる。最高生育温度に関しては、 <I>E. nidulans</I> や <I>E. rugulosa</I> と同じ 48℃を示した。また、これら 3 種の各種培地上におけるコロニーの大きさは PDA 培地で明瞭な差が見られた。

<I>Talaromyces </I>属およびその関連菌である <I>Hamigera</I>、<I>Byssochlamys</I> 属は、子嚢胞子が耐熱性を示すことから食品、飲料などの製造過程における事故原因菌として重要である。<I>Talaromyces</I> 属は、Pitt(1979)によれば<I>Talaromyces</I>、<I>Purpureus</I>、<I>Thermophilus</I> の 3 section に分けられ、タイプ種 <I>T. flavus</I> を含む sect. <I>Talaromyces</I> のみ series <I>Flavi</I>、<I>Lutei</I>、<I>Trachyspermi</I> に細分され、sect. <I>Purpureus</I>、<I>Thermophilus</I> はそれぞれ1種のみから構成されている。本属には <I>Penicillium</I> 以外に <I>Geosmithia</I>、<I>Paecilomyces</I> をアナモルフとする数種があり、これらは Stolk、Samson (1972) の sect. <I>Emersonii</I> が相当する。その後、Tayler 及び杉山らにより本属は分子系統的に多系統と指摘された。今回、最近追加された種を含む 42 種および関連菌の 28S rDNA D1/D2 領域、b-チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、NJ 法により系統解析を実施した。その結果、2 遺伝子の解析からえられた系統樹はほぼ一致し、次の 5 群に再分類された。1) ser. <I>Flavi</I> の主要種から構成される菌群、2) ser. <I>Trachyspermi</I>、<I>Lutei</I> の一部から構成される菌群、3) ser. <I>Lutei</I> の一部を除いた種から構成される菌群、4) <I>T. luteus</I>、<I>T. ocotl</I>、<I>T. thermophilus</I> から構成される菌群、5) sect. <I>Emersonii</I> の一部の種から構成される菌群である。一方、<I>T. purpureus</I> は ser. <I>Flavi</I> と、<I>T. leycettanus</I>、<I>T. spectabilis</I>、<I>T. striatus</I> は <I>Hamigera</I>、<I>Byssochlamys</I> 属と系統的に近縁であった。全体として、ser. <I>Flavi</I> と 2) の <I>Trachyspermi</I>、及び 3) の <I>Lutei</I> の一部からなる菌群が単系統的なまとまりを示した。この結果を用いて、<I>Talaromyces</I> 属の各菌群、<I>Hamigera</I>、<I>Byssochlamys</I> 属それぞれの検出法を検討した。

<I>Aspergillus</I> section <I>Fumigati</I> に分類される菌は土壌中に極普通に生息し、ヒトのアスペルギルス症原因菌となる他、痙攣性カビ毒の生産菌、加熱加工食品の事故菌として報告され、我々の生活に深く関係する菌である。Section <I>Fumigati</I> に分類される種の出現は <I>A. fumigatus</I> が圧倒的に多く、他種の分離例は稀であり、種間の形態的特徴も少ないため、これら非 <I>A. fumigatus</I> 種の研究はsection <I>Fumigati</I> のテレオモルフである <I>Neosartorya</I> と比べ遅れていた。近年、分子生物学的手法を用いての種間の系統関係の研究が進み新たな種も報告されている。現在までのところ <I>A. brevipes、A. duricaulis、A. fumigatiaffinis、A. fumigatus、A. fumisynnematus、A. lentulus、A. novofumigatus、A. turcosus、A. unilateralis、A. viridinutans</I> などが報告されている。また、<I>Neosartorya</I> のヘテロタリック種である <I>N. fennelliae、N. nishimurae、N. otanii、N. spathulata、N. udagawae</I> なども同様の形態を呈する。これら多くの種の集落は <I>A. fumigatus</I> と異なり、分生子構造形成が少なく、分生子の色が集落の色に反映せず白色及び淡緑灰色を呈する。そのため分離培地上では <I>Aspergillus</I> と認識される事は少なかった。近年、これらの種の分類には分子生物学的データを重要視し、他の <I>Aspergillus</I> の分類で重要視される分生子の形態学的特徴や集落の色は軽視される傾向がみられ、中には標本を見ないでデータのみで種の改廃をおこなっている報告も認められる。今回、我が国をはじめ、中国、ブラジルなどの広い地域の土壌から分離した非 <I>fumigatus</I> に <I>Neosartorya</I> のヘテロタリック種を加え分子生物学的手法と形態学的手法を用い非 <I>fumigatus</I> を評価し、併せてこれまで <I>A. fumigatus</I> とされていた病原真菌研究や痙攣性カビ毒研究に用いられている重要な株の分類学的位置についても考察を加える。

<I>Pseudallescheria boydii</I> は世界的に広く土壌中に棲息し、BSL-2 にランクされている。そのアナモルフである <I>Scedosporium apiospermum</I> と共に、菌腫、角膜真菌症、肺菌球症などの起因菌種として知られている。近年、侵襲性肺真菌症、関節炎など日和見真菌症の起因菌として重要度が増し、近縁種 <I>S. prolificans</I>、<I>S. aurantiacum</I> と共に薬剤抵抗性からも問題視されている。我々は、千葉大真菌センターに保存されているこれら菌種に関して、形態、生育温度を再検討比較し、ITS 領域による多型解析を行った。さらに、若干の疫学的データを整理し、薬剤感受性試験を実施した。今回検討した菌株中、本邦初の分離となる <I>S. aurantiacum</I> が 1 株認められた。<I>S. apiospermum</I> の最高生育温度は 40-42℃、<I>S. prolificans</I> は 42-45℃、<I>S. aurantiacum</I> は 42℃ であった。系統解析の結果、<I>S. apiospermum</I> は単系統のクラスターにまとまり、さらに 4 サブクラスターに細分され、日本の臨床分離株はその中の 3 つに分布し、<I>S. prolificans</I> と <I>S. aurantiacum</I> はそれぞれ独立したクラスターを形成した。また、<I>S. prolificans</I> は voriconazole はじめ今回試験したすべての薬剤に対して抵抗性を示した。結論として、<I>S. apiospermum</I> の臨床分離株は表現型、遺伝子型共に多様性を示し、<I>S. apiospermum</I> と <I>S. aurantiacum</I> は表現型では識別できなかった。