華岡 光正

高等植物において色素体は組織や発達時期に応じて様々な形態へと分化する。我々の研究室では、シロイヌナズナ緑葉由来のT87培養細胞を遮光状態で培養して白化させた細胞をベースに、光照射の有無、あるいは加える植物ホルモンを調整することで、アミロプラストや葉緑体への分化を誘導する系を確立した。このうち、原色素体からアミロプラストへの分化誘導では、タバコBY-2細胞を用いた分化誘導系（Miyazawa et al., 1999）での知見と同様に、アミロプラスト分化を特徴づけるデンプン粒の蓄積が観察された。また、このデンプン蓄積は、カナマイシンなどの色素体遺伝子発現の阻害剤を加えることで有意に低下することが示された。BY-2細胞では、これら一連の分化誘導、阻害条件と連動して核ゲノムにコードされているデンプン合成遺伝子群の発現量が変動することが確認されている（本橋ら、本年会）。この現象は、核コードの光合成関連遺伝子LhcBの発現制御におけるプラスチドシグナルの関与と類似していると言える。本発表では、これまで葉緑体から核への情報伝達における役割を中心に研究が進められてきたプラスチドシグナルが、アミロプラストを含む多様な色素体への分化機構においても関与しているかについて、T87細胞への形質転換系を駆使したプラスチドシグナル関連遺伝子群の遺伝学的解析の結果も交えながら議論したい。

高等植物の色素体は、組織依存的に、また光などの環境変化に応答して多様に分化する。このうち、非光合成組織に存在するアミロプラストは、デンプン合成や蓄積に関わる色素体であるが、その分化機構については不明な点が多い。タバコBY-2細胞は通常オーキシン培地で増殖するが、加えるホルモンをサイトカイニンに置換すると色素体は原色素体からアミロプラストへ分化することが知られている。この際に、核コードのAGPSなどデンプン合成遺伝子の発現が誘導されることは示されているが、色素体遺伝子発現の関与や役割については不明であった。<br> 本研究ではまず、マイクロアレイ解析により色素体転写量の変化を調べたが、アミロプラスト分化時に顕著に誘導される遺伝子は見当たらなかった。しかし、分化誘導と同時に色素体の転写・翻訳阻害剤を添加すると、デンプン合成量が低下しアミロプラストへの分化が阻害された。また、この阻害はAGPSなど核コード遺伝子の発現が抑制されるためであることが示され、色素体での正常な遺伝子発現の情報が何らかのシグナルを介して核に伝わる可能性が予想された。そこで、色素体由来のシグナルとして既に知られているテトラピロール中間体やその合成阻害剤の影響を調べた結果、特にヘムが分化の制御に関与している可能性を示す結果が得られた。これらの結果から、アミロプラスト分化における核と色素体間の情報伝達系について議論したい。

Cyanidioschyzon merolae（シゾン）は硫酸酸性の温泉に生息する光独立栄養性の単細胞紅藻であり、一細胞当たりに核、葉緑体、ミトコンドリアをそれぞれ一つずつ有する単純な細胞構造をとる。シゾンは核と葉緑体において多くの遺伝子が明暗により制御されることに加え、遺伝子構成が単純であることから、光情報伝達機構の解明に優れたモデル植物として期待される。<br>高等植物では、DET1は暗所において光応答性遺伝子発現を負に制御する因子として知られ、発生や分化など幅広い細胞機能に深く関わる。DET1はクロマチンと結合能を有し、Cul4-DDB1と複合体を形成してクロマチン構造を介した転写制御を行っていると予想されているがその詳細な機構は明らかとなっていない。<br>シゾンのゲノム上にはDET1が存在し、DET1が光応答性遺伝子群の発現調節に関わることが予測された。そこで、DET1が担う分子機構を解明することを目的とし、シゾンにおいてdet1破壊株を作製した。まず、この株を明暗条件下で培養したところ、増殖の阻害が認められた。次に明暗における光応答性の遺伝子についてノーザン解析を行ったところ、高等植物と同じように一部の核、葉緑体コードの遺伝子が暗条件においても高いレベルで蓄積していた。現在、転写抑制の代表的なマークであるヒストンH3K9のジメチル化とDET1との関連についての解析を進めている。

葉緑体は、独自のDNAとその転写・翻訳システムを持っている。これまでに、葉緑体分化や環境応答に際した転写制御の研究が行われてきたが、その多くは目的因子の欠損株を用いた遺伝学的手法が中心であった。しかし、対象因子が生育に必須であったり、重複した機能を持つパラログにより欠損の影響が相補されたりするなど、解析が困難である場合も多く見られた。これらの問題点を解決する手法として、目的転写因子のin vivoでの結合状態を直接モニターすることが可能なクロマチン免疫沈降（ChIP）法が最近特に注目されている。<br>本研究では、ChIP法を利用してシロイヌナズナ葉緑体におけるシグマ因子の機能解析を行った。まず、ストレス応答シグマ因子SIG5とその標的遺伝子との関係を調べ、SIG5のターゲットとして既に知られているpsbAやpsbD BLRPに加え、新たにpsbBTなどのプロモーターにもSIG5が特異的に、かつストレスに応答して結合することを見いだした。また、シロイヌナズナでは必須のシグマ因子であるSIG1についても同様に解析を行い、イネでSIG1の標的として報告されているpsaABプロモーターなどへの特異的結合を確認することができた。以上の結果は、ChIP法が葉緑体の転写制御研究において有用であることを示しており、得られた結果をもとにストレス条件下でのSIG1とSIG5の機能分担について考察する。

植物にとって窒素は極めて重要な栄養素であり、植物における窒素同化の制御や調節の仕組みの解明は極めて重要である。我々は単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）をモデル系として、光合成真核細胞における窒素飢餓応答の解析を進めている。今回我々は、窒素飢餓時におけるシゾン細胞の挙動について観察し、色素量の減少や細胞の小型化について解析したので報告する。また遺伝子発現レベルでの窒素飢餓応答機構についても解析した。DNAマイクロアレイ解析の結果、窒素枯渇条件下において窒素同化遺伝子群と共にR2R3型MYB転写因子遺伝子(CmMYB1）の発現が誘導されることが明らかになった。また、CmMYB1のタンパク質レベルでも窒素枯渇条件下で顕著な誘導が観察され、それらの核への局在が確認された。クロマチン免疫沈降・ゲルシフト解析の結果、CmMYB1が窒素枯渇下特異的に窒素同化遺伝子群のプロモーター領域に結合していることが明らかとなった。更に、CmMYB1遺伝子欠損株においては、窒素枯渇下における窒素同化遺伝子群の発現誘導は全く観察されなかった。これらのことから、CmMYB1が窒素枯渇下において窒素同化遺伝子群の発現を正に制御している転写因子であることが明らかになった(1)。<br>【参考文献】<br>(1) Imamura et al. (2009) PNAS 106, 12548-1255

植物細胞において、核DNA複製(nuclear DNA replication: NDR)とオルガネラDNA複製(organelle DNA replication: ODR)を協調させる機構については殆ど明らかにされていなかった。近年、我々は単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolaeおよびタバコ培養細胞BY2においてNDRがODRによって制御されていること、そしてオルガネラからNDRの開始を伝えるシグナルとしてテトラピロールの一種であるMg-ProtoIXが働いていることを明らかにした。NDRはMg-ProtoIXの蓄積によってCDKAが活性化される事によって行われる¹。しかし、Mg-ProtoIXによるCDKAの活性化がどのような分子機構によって行われているかは不明であった。前年会で我々はCDKAの活性化は、F-boxタンパク-Fbx3 によるCyclin 1のユビキチン化がMg-ProtoIXによって阻害されるために起こる事をin vitro実験系により明らかにした。今回、in vivoの実験系を用いて更なる検証を行ったので報告する。これらの実験結果をふまえたMg-ProtoIXによるNDRの開始機構のモデルを提示する。<br>1 Kobayashi, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 803 (2009).

葉緑体には、原始シアノバクテリアの細胞内共生に由来する独自のゲノムとその遺伝子発現系が残されている。しかし、共生後の長い進化の過程で多くの遺伝子が葉緑体から失われ、それと並行して環境応答などの制御系は核による支配を強く受けるようになった。本研究で用いた単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）は、そのゲノム構造や転写制御系の解析から多くの原始的な特徴を保持していることが示されており、より自律的な環境応答・転写制御系が葉緑体に残されているものと予想される。我々はこれまでに、シゾンに唯一残されているヒスチジンキナーゼ（HIK）と葉緑体ゲノムに残されたレスポンスレギュレーターの1つであるYcf27が、光に自律応答した葉緑体の転写制御に関わることを明らかにしてきた。本研究ではHIKの機能解析を目的とし、まずHIKタンパク質の発現量を調べたところ、光条件に関係なく一定であることが示されたため、光依存的に活性が変化するセンサーとしての役割が予想された。そこで、光センシングに関わると考えられるN末端側のドメインをシアノバクテリアの系を用いて発現・精製した。このタンパク質を用いてZinc-blot解析を行った結果、明確なシグナルは得られなかったことから、フィコシアノビリンなどの開環テトラピロール化合物とは異なる別の分子が発色団として結合している可能性が示唆された。

単細胞紅藻Cyanidioschzon merolae(シゾン)において、暗所でG1期に同調した細胞に光を照射すると、まずオルガネラDNA複製(ODR)が起こり、その後に核DNA複製(NDR)が誘導される。この際、ODRを特異的に阻害するとNDRも同時に阻害されることから、ODRはNDRの誘導に必須であることが判る。我々のこれまでの研究で、色素体で合成されるMg-Protoporphyrin IXがODR後に細胞内に蓄積し、それに依存してCDKAが活性化されることでNDRが誘導されることが明らかになっている^{1, 2}。一方、光によりODRが活性化される分子機構については全く不明のままである。最近我々は、CDKの活性を広く阻害する薬剤(Roscovitine)を用いた解析から、未知のCDK複合体がODR開始に必須であることを見出した。本研究では光によるODR活性に関わるCDK複合体を同定するために、DNA合成期における各種のCDKとCyclinの発現について解析を行ったので報告する。<br>¹ Kobayashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106:803-807 (2009)<br>² Kanesaki et al. Plant Signal. Behav. in press (2009)

葉緑体は独自のゲノムとその発現系を有しており、分化や環境応答に際した転写制御の解析が広く展開されてきたが、その多くは生化学、遺伝学的手法をベースとしている。しかし、前者ではin vivoでの機能の説明が難しく、また後者では転写因子の直接の制御の理解が難しい。さらに、必須遺伝子の場合や重複機能を持つ遺伝子が存在する場合は欠損の影響が明確ではなく、解析困難なケースも実際に多く見られた。これら問題点を解決する技術が、クロマチン免疫沈降（ChIP）法である。この手法は、細胞中のDNA-タンパク質間の結合を固定し目的のタンパク質の抗体で免疫沈降することで、in vivoでの転写因子の結合状態をモニターすることのできる画期的な解析法である。<br> 我々は、このChIP法をシロイヌナズナの葉緑体転写制御研究に導入し、従来の手法では見えてこなかった新しい制御系の理解を目指している。実験系の有効性を検証するため、ストレス応答シグマ因子SIG5とそのターゲット遺伝子との関係をChIP法により解析した。その結果、psbAやpsbD BLRPなどのプロモーター特異的に、また強光などのストレス依存的にSIG5の結合が検出された。この結果は、ChIP法が葉緑体転写制御系の解析において有力なツールとなることを示唆しており、欠損株のアレイ解析では同定されなかった新規ターゲット遺伝子の有無についても報告する。

TFIIB とその相同蛋白質である BRF は、それぞれ RNA ポリメラーゼ II と RNA ポリメラーゼ III の転写開始に不可欠な基本転写因子である。しかし、菌類や動物を用いたこれまでの研究により、RNA ポリメラーゼ I（Pol I）に対応するTFIIB 型の転写因子は存在しない事が明らかになっている。最近、植物のゲノム解析や他の研究により、植物が TFIIB や BRF と異なる、第3の TFIIB 型転写因子 pBrp を持つ事が明らかにされたが、その機能についてはこれまで不明であった。<br> 本研究では、モデル植物である単細胞性紅藻 Cyanidioschyzon merolae （シゾン）を主に用い、pBrp の機能解析を行った。その結果、pBrp が Pol I に特異的な TFIIB 型転写因子であり、リボソーム DNA (rDNA) の転写に正に関わる事が明らかになった。更に、シロイヌナズナにおいても、pBrp が rDNA の転写に関わる証拠を得た。これらの事から、pBrp は植物において一般に、 Pol I と共に rDNA の転写に関わる基本転写因子であると結論付けた [1]。これらの結果を元に、TFIIB 型転写因子の進化過程について考察する。<br>[1] Imamura et al., (2008) EMBO J 27: 2317-2327

葉緑体の起源は原始シアノバクテリアによる細胞内共生であると考えられており、共生に由来する独自のゲノムとその遺伝子発現システムを継承している。しかしながら、共生当初の自律性はその後の長い年月を経る中で徐々に失われ、それに代わって様々な制御系は細胞核による支配を強く受けるようになった。本研究で用いた単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）はそのゲノム構造や転写制御システムに多くの原始的な特徴が見られ、高等植物と比較してより自律的な遺伝子発現制御がなされているものと予想される。我々は、単離葉緑体を用いたRun-on転写系とクロマチン免疫沈降法（ChIP法）を展開し、光に自律応答した一群の光合成遺伝子の転写制御には、シゾンに唯一残されているヒスチジンキナーゼ（HIK）と葉緑体ゲノムにコードされているレスポンスレギュレーターの1つであるYcf27から構成される二成分制御系が関与することを明らかにした。また、光合成電子伝達阻害剤を用いた解析の結果、この転写制御にはプラストキノンの酸化還元状態に依存したレドックス制御は関与しない可能性が示唆された。HIKの構造的進化に関する知見も踏まえ、シゾン葉緑体における光に応答した転写制御のメカニズムについて考察する。

In cyanobacteria, a series of genes are induced by, and cause tolerance to, high light stress conditions. Some of these genes share a short, repeated sequence motif known as a high light regulatory 1 (HLR1) element in their promoter regions. Previously, RpaB, a two-component response regulator, was shown to interact with the HLR1 element of several high light-responsive promoters in vitro. However, how RpaB regulates target promoters in vivo remained elusive. In this study, we analyzed the role of RpaB in transcriptional regulation of high light-responsive genes by chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis, which has been recently developed and utilized to study in vivo interactions between DNA-binding proteins and the relevant target DNA. One of the advantages of this method is the ability to detect dynamic interaction patterns in response to various growth and/or environmental conditions instantaneously at the time of the analysis. Here we examined the binding patterns of RpaB under various light conditions using ChIP assays. We found that strong interactions of RpaB with target promoters were weakened in a high light-dependent manner, and that the lower binding level of RpaB continued as long as the high light conditions were maintained. Thus, in regulation of high light-inducible genes, we suggest that RpaB functions as a repressor under normal light conditions, and that high light conditions result in release of the repression.

色素体は、細胞分化や環境変化に応答して葉緑体・有色体・白色体・アミロプラストなどへ分化する。アミロプラストは非光合成組織に存在し、デンプン合成に関わる色素体であるが、その分化機構の詳細についてはほとんど知見がない。タバコ培養細胞BY-2は通常オーキシン存在下で増殖するが、培地中のオーキシンをサイトカイニンに置換することでプロプラスチドからアミロプラストへ分化することが知られている。この分化の際に、核コードのADP-glucose pyrophosphatase（Agp）など、デンプン合成に関わる遺伝子の発現が誘導されることが示されているが、色素体遺伝子発現の関与については不明であった。<br>本研究ではまず、アミロプラスト分化における色素体遺伝子発現の変化をノーザン解析により検討したが、発現が変動する遺伝子は見いだされなかった。一方、分化誘導と同時に色素体の翻訳阻害剤スペクチノマイシンまたは転写阻害剤リファンピシンを添加すると、デンプン合成量の低下とともにアミロプラストへの分化が阻害された。さらにこの際、Agpなど核コードのデンプン合成に関わる遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが明らかになった。以上の結果は、色素体での正常な転写や翻訳が、未知のシグナルを介してアミロプラスト分化に必須である可能性を示唆している。

葉緑体には、原始シアノバクテリアの細胞内共生に由来する独自のゲノムとその発現系が残されているが、共生後の進化の過程で多くの遺伝子が失われたとともに、環境応答などの制御系は核による支配を強く受けるようになった。単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolaeは、その葉緑体ゲノムや転写制御系の解析から共生当初により近い状態を反映していると考えられ、核によるものとは別の、葉緑体自律的な制御系が今なお残されていると予想される。そこで本研究では、葉緑体ゲノムにコードされた原核型転写因子Ycf27の解析を通じて、C. merolaeの葉緑体における光に応答した特徴的な転写制御システムの解明を目的とした。<br> これまでに、暗条件下で培養した細胞から単離した葉緑体に対して光照射を行った結果、ycf27、psbDの転写活性が特異的に上昇することがrun-on転写系により示された。この制御には、二成分制御系のレスポンスレギュレーターであるYcf27が関与することが予想されたが、その詳細については不明であった。上記と同様の光条件下におけるYcf27の結合についてクロマチン免疫沈降法を用いて調べた結果、Ycf27のこれらプロモーターへの結合は暗条件下で強く、光照射により弱まることが分かった。この結果は、葉緑体が自律的な光応答系を介して特定の遺伝子群の転写を制御していることを強く示唆している。

Among the sigma70 family bacterial sigma factors, group 2 sigma factors have similar promoter recognition specificity to group 1 (principal) sigma factors and express and function under specific environmental and physiological conditions. In general, the cyanobacterial genome encodes more than four group 2 sigma factors, and the unicellular Synechococcus elongatus PCC 7942 (Synechococcus) has five group 2 sigma factors (RpoD2-6). In this study, we analyzed expression of group 2 sigma factors of Synechococcus at both mRNA and protein levels, and we showed that the rpoD3 expression was activated only by high light (1,500 micromol photons m(-2) s(-1)) among the various stress conditions examined. After high light shift, rpoD3 mRNA accumulated transiently within the first 5 min and diminished subsequently, whereas RpoD3 protein increased gradually during the first several hours. We also found that the rpoD3 deletion mutant rapidly lost viability under the same conditions. Analysis of the rpoD3 promoter structure revealed the presence of an HLR1 (high light-responsive element 1) sequence, which was suggested to be responsible for the high light-induced transcription under the control of the NblS (histidine kinase)-RpaB (response regulator) two-component system (Kappell, A. D., and van Waasbergen, L. G. (2007) Arch. Microbiol. 187, 337-342), at +6 to +23 with respect to the transcriptional start site. Here we demonstrated that recombinant RpaB protein specifically bound to HLR1 of the rpoD3 and hliA genes in vitro, and overexpression of a truncated RpaB variant harboring only the phosphoreceiver domain derepressed the transcription in vivo. Thus, we have concluded that phosphorylated RpaB are repressing the rpoD3 and hliA transcription under normal growth conditions, and the RpaB dephosphorylation induced by high light stress results in transcriptional derepression.